Erythrodermie

Erythropoetin (Synonyme: EPO, Erythropoietin, Epoetin) ist ein Glykoprotein-Hormon, das als Wachstumsfaktor für die Bildung roter Blutkörperchen (Erythrozyten) während der Hämatopoesevon entscheidender Rolle ist.

Herkunft und Wirkung

Im Menschen wird das EPO vorwiegend in der Nieredurch die Endothelzellen der peritubulären Kapillaren und in deutlich geringeren Mengen auch durch die Hepatozytender Lebergebildet. Zudem konnte eine Syntheseaktivität im Gehirnund Uterusnachgewiesen werden. Das EPO-Gen im Menschen befindet sich auf dem Chromosom7 (Position 7q21). Die Synthese wird stimuliert durch eine verminderte Sauerstoffsättigung des Blutes in den Nierenarterien. Die Serumkonzentration des Hormons im gesunden Menschen liegt bei bis zu 19 mU/mL. Im Knochenmark bindet EPO an den membranständigen Erythropoetin-Rezeptorder Erythroblasten. Dies führt zur Teilung dieser Progenitorzellen, die schließlich zu Erythrozyten ausdifferenzieren. So werden ca. 200 Milliarden Erythrozyten pro Tag gebildet. Akute und chronische Insuffizienzeninfolge degenerativer Erkrankungen der Niere führen zu verminderten EPO-Bildung und damit zur renalen Anämie.

Strukturelle Eigenschaften

Chemisch ist humanes EPO ein saures, unverzweigtes Polypeptidaus 165 Aminosäure-Monomerenund einem Molekulargewicht von ca. 34 kDa. Der Kohlenhydratanteil, der etwa 40 % der Molekülmasse beträgt, besteht aus einer O-glykosidisch (Ser 126) und drei N-glykosidisch (Asn 24, Asn 38 und Asn 83) gebundenen Zuckerseitenketten. Die Seitenketten ihrerseits setzen sich aus den MonosaccharidenMannose, Galaktose, Fukose, N-Acteylglucosamin, N-Acetylgalactosaminund N-Acetylneuraminsäurezusammen. Letztere, auch unter dem Trivialnamen Sialinsäurenbekannt, sind entscheidend für die biologische Aktivität des Glykoproteins: Je höher der Sialylierungsgrad, desto höher ist die Aktivität und Serumhalbwertszeit des Hormons. Natives EPO tritt in drei Varianten auf: Alpha, Beta und Asialo. Die asialylierten Isoformen, bei denen die endständigen Sialinsäuren entfernt sind, werden unmittelbar in der Leber abgereichert und sind somit wirkungslos.

EPO als Therapeutikum

Die Isolierung und Reinigung von humanem EPO aus Uringelang zu Beginn der 1970er Jahre. 1983wurde die Aminosäuresequenz entschlüsselt. 1984wurde erstmals von einer erfolgreichen Klonierung und Expression eines rekombinanten EPO (rEPO) in Escherichia coliberichtet (Quelle: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 2708 (1984)), 1985gelang dies erstmals in Säugetierzellen (Quelle: Nature 313, 806 (1985)). Das US-amerikanische Biotechnologieunternehmen Amgenbrachte 1989 das erste rekombinante EPO-Präparat (Epogen®) auf den Markt. Krebs- und Nierenpatienten konnten hiermit bei der Therapie von Anämien wesentlich nebenwirkungsärmer als durch Bluttransfusionenbehandelt werden. Zu Amgen gesellten sich im Verlauf der Zeit weitere Firmen (Hoffmann-La Rochemit NeoRecormon®, Johnson & Johnsonmit Eprex®/Procrit®, Elanex Pharmaceuticalsbzw. seit 2001 Baxtermit Epomax®). 2001generierte Amgen unter dem Handelsnamen Aranesp® (Darbepoetin ?) ein gentechnisch verändertes Erythropoetin. Dieses enthält durch den Austausch von Aminosäuren weitere Zuckerseitenketten, wodurch sich der Anteil endständiger Sialinsäuren und hierdurch die Serumhalbwertszeit erhöht. Ein Gemeinschaftsunternehmender Firmen Sanofi-Aventisund Transkaryotic Therapiesbeabsichtigen die Vermarktung eines durch Genaktivierung aus transformierten, humanen Zellen erzeugten EPO unter dem Markennamen DynEpo®. Als Therapeutikum rangiert EPO unter den 10 weltweit erfolgreichsten Medikamenten überhaupt, unter den Biopharmazeutika ist es der herausragende Blockbuster. Eprex®/Procrit ® von Johnson & Johnson erzielte im Jahr 2004 $US 3,6 Milliarden, Amgens Epogen® $US 2,6 Milliarden und Roches NeoRecormon® $US 1,7 Milliarden (Quelle: Chemical & Engineering News Nr. 83). Weltweit werden ca. 350.000 Patienten mit rekombinantem EPO behandelt.

EPO-Doping

Je mehr rote Blutkörperchen dem menschlichen Blutkreislaufzur Verfügung stehen, desto leistungsfähiger arbeitet der gesamte Organismus, weil entsprechend viel Sauerstoffden Zellen zur Verfügung steht. Aus diesem Grund wird EPO bereits ca. seit Ende der 80er Jahre des vergangenen Jahrhunderts zum Zweck der Leistungssteigerung missbraucht. Vor allem Ausdauersportler profitieren von der Wirkung; durch den erhöhten Anteil an Erythrozyten im Blut steigt allerdings die Gefahr von Blutgerinnseln. EPO wurde mit der gewichtigen Nebenrolle, die es bei der Tour de France1998 unter anderem durch Funde bei der Festina-Mannschaft erlangte, Inbegriff der leistungssteigernden, aber nur schwer nachweisbaren Sportdroge. Die Funde und die Ermittlungen rund um die Festina-Mannschaft wurden auch unter dem Namen Festina-Affärebekannt. Bei den Olympischen Winterspielen in Salt Lake City2002wurde der für Spanienstartende Ski-Langläufer Johann Mühleggder Einnahme von Darbepoetin überführt und der Gewinn dreier Goldmedaillen daraufhin annulliert. EPO und das Derivat Darbepoetin stehen auf der Dopinglisteder internationalen Anti-Doping-Organisation WADA, ihr Einsatz ist also im Wettkampfsport verboten. Im Dezember 2004wurden laut einem Bericht der französischen Zeitung L'Équipe vom 23. August 2005 in tiefgefrorenen Urinkonserven des siebenmaligen Tour-de-France-Siegers Lance Armstrongsowie sechs weiterer Radprofis aus dem Jahr 1999 Spuren von nicht körpereigenem EPO nachgewiesen. Jedoch bestreitet Armstrong gedopt zu haben. Im November 2005 wurde Vuelta-Rekordsieger Roberto Heraspositiv auf EPO getestet.

Nachweismethode

EPO kann auch in geringen Konzentrationen durch ein mehrstufiges Verfahren im Urin nachgewiesen werden. Im ersten Schritt werden zunächst die im Urin enthaltenen Proteine durch Mikro- und Ultrafiltrationaufkonzentriert. Im zweiten Schritt erfolgt die Trennung zwischen humanem und rekombinantem EPO sowie der anderen enthaltenen Proteine mittels isoelektrischer Fokussierung(IEF) in einem Polyacrylamid-Gel mit geeignetem pH-Gradienten. Glykosilierungen von Proteinen erfolgen speziesspezifisch, d.h. das Glykosilierungsmuster von humanem EPO unterscheidet sich vom rekombinanten EPO anderer Spezies. Rekombinantes EPO wird gegenwärtig mit Hilfe transformierter Zelllinien des Hamsters(Cricetulus griseus) erzeugt (CHO = Chinese Hamster Ovary , BHK = Baby Hamster Kidney). Beim rekombinanten EPO ist die Neuraminsäurezu etwa 95% an Stickstoffacetyliert, etwa 2% liegen als Glykolylacetyl-Derivat vor. Der Grad dieser unterschiedlichen Acetylierungsowie die An- und Abwesenheit sogenannter Repeats (immer wiederkehrende Zuckereinheiten) sind verantwortlich für unterschiedliche isoelektrische Punkte (pI) von humanem und rekombinantem EPO. Diese Eigenschaft wird analytisch bei der IEF zum EPO-Nachweis ausgenutzt. Im dritten Schritt erfolgt der eigentliche Nachweis durch ein Immunoblotting, bei dem die im Elektrophoresefeld aufgetrennten EPO-Isoformen auf eine Membranüberführt und nachfolgend mit einem EPO-spezifischen monoklonalen Antikörper(MAK) überschichtet werden. Die bindenden MAK werden anschließend im sauren Millieu und durch Anlegen eines elektrischen Feldes dissoziiert und auf eine zweite Membran übertragen. So erhält man ein erneutes Abbild der einzelnen EPO-Banden. Allerdings befinden sich auf der zweiten Membran keine EPO-Moleküle, sondern die spezifischen monoklonalen Antikörper. Die Sichtbarmachung der Antikörperbanden erfolgt durch einen Anti-EPO-MAK spezifischen zweiten Antikörper. Dieser Sekundärantikörper ist an bestimmte Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidaseoder alkalische Phosphatase) gekoppelt, die eine Substratumsetzung katalysieren, welche sich mittels Chemiluminiszenzverfahren quantifizieren lässt.

Weblinks

• Epogen®
• Aranesp®
• NeoRecormon®
• Eprex®
• Procrit®
• Epomax®
• DynEpo®

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