Antikörperfärbung

Als Antikörperfärbung oder auch Immunfärbung, Immunhistochemie wird in der Biologieund Medizineine Methode bezeichnet, mit der Proteinemit Hilfe von Antikörpernsichtbar gemacht werden können. Damit kann beispielsweise bestimmt werden, in welchem Gewebedas Protein vorhanden ist und auch, in welchem Kompartimentder Zellees lokalisiert ist. Beispielsweise färben Transkriptionsfaktoren, die im Zellkernlokalisiert sind, nur den Zellkern an, membranständige Proteine Teile der Zellmembranusw. Für Antikörperfärbungen wird fixiertesGewebe verwendet, das entweder aus vollständigen Tieren (Embryonen von Zebrafisch, Drosophila melanogasteretc.) oder aus Gewebeschnitten bestehen kann (zum Beispiel Mikrotomschnittevon Organen der Maus oder des Menschen). Zellen aus Körperflüssigkeiten oder Punktaten u.ä., die mittels Zentrifugation auf einen Objektträger aufgebracht wurden, oder auf einem Objektträger gewachsen sind (Zellkulturtechnik), können ebenfalls immunhistochemisch untersucht werden.

Grundlagen der Immunchemie

Voraussetzung für die Durchführung einer immunhistochemischen Färbung ist ein Antikörper, der spezifischgegen das Protein gerichtet ist, das man darstellen/sichtbar machen möchte. Es gibt mehrere Methoden der immunhistochemischen Färbung. Die Wahl der Methode ist abhängig von der Art und Lokalisation des zu untersuchenden Proteins und der Art und Beschaffenheit des zu untersuchenden Gewebes/der Zellen. Die Qualität der Färbung ist abhängig von der Fixierung des Materials (Gewebe, Zellen), der richtigen Verdünnung des Antikörpers, der optimalen Inkubationszeit aller Reagenzien, sowie der optimalen Temperatur.

Prinzip der immunhistochemischen Färbung

Direkte Methode (älteste Methode)

Das zu untersuchende Antigen (=Protein im Zellkern/ im Zytoplasma/ auf der Zellmembran) wird unter definierten Bedingungen mit einem spezifischen Antikörper zusammengebracht, der mit einem Enzym gekoppelt (konjugiert) ist. Der Antikörper (und somit das Enzym) bindet an das Antigen, nicht gebundener Antikörper wird abgespült. Dem Enzym wird in einem weiteren Schritt ein Substrat angeboten, das unter Bildung eines Farbstoffs mit dem Enzym reagiert. Dieser Farbstoff bildet sich dort, wo die immunchemische Reaktion stattgefunden hat und ist sichtbar. Einfach ausgedrückt: Antigen + Antikörper mit Enzym + Substrat = Farbe

Indirekte Methode

Bei dieser Methode wird im ersten Schritt ein spezifischer Antikörper (Primärantikörper) auf das zu untersuchende Gewebe/Zellen aufgebracht. In einem zweiten Schritt wird ein Antikörper aufgetragen, der sich gegen den ersten AK richtet. Es ist der sog. Sekundärantikörper, der hier mit einem Enzym gekoppelt ist und die Farbentstehung mit einer Enzym-Substrat-Reaktion auslöst. Wieder entsteht ein sichtbarer Farbstoff. Einfach: Antigen + Primärantikörper + Sekundärantikörper mit Enzym + Substrat = Farbe Die indirekte Methode gibt es als Zwei-Schritt-Methode und als Drei-Schritt-Methode. Bei der Drei-Schritt-Methode wird ein weiterer, mit einem Enzym gekoppelter, AK (=Tertiärantikörper)zugegeben. Dieser bindet an den Sekundärantikörper. Dieser Schritt dient der Signalverstärkung und ist sinnvoll, wenn Antigene mit wenigen Epitopen dargestellt werden sollen.

Spezifischer Nachweis definierter Antigene im Gewebsschnitt mittels Antikörper

(Strept)Avidin-Biotin-Methode

Heutzutage ist diese Färbemethode die am meisten eingesetzte. Das Prinzip basiert auf der hohen Affinität von Streptavidin (Streptomyces avidinii) und Avidin (Hühnereiweiß) für Biotin. Streptavidin und Avidin besitzen jeweils 4 Bindungsstellen für Biotin. Die Reihenfolge der Reagenzien: Unkonjugierter Primärantikörper + biotinmarkierter (=biotinylierter) Sekundärantikörper + Avidin-Biotin-Enzymkomplex + Substrat = Farbe

Diese kurz vorgestellten Methoden sind eine Basis. Es gibt einige modifizierte Färbeprotokolle, oder neu entwickelte Substanzen, die sich aber im Grundätzlichen in den drei Methoden wiederfinden. So kann ein Sekundärantikörper auch mit Fluoreszenz markiert sein und auf diesem Weg eine vorhergegangene Antigen-Antikörper-Reaktion sichtbar machen. Die Färbungen können manuell vorgenommen werden oder automatisiert. Es gibt einige Firmen, die Färbeautomaten anbieten. Ausserdem gibt es eine Vielzahl an fertigen Test-Kits, die die Durchführung der Färbungen vereinfachen und sicher auch zur Standardisierung beitragen.

Enzyme, Substrate und Chromogene (häufig verwendete)

Peroxidase (POD)

• DAB (3,3'-Diaminobenzidin) bildet ein braunes Endprodukt
• AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazol) bildet ein rosenrotes Endprodukt
• CN (4-Chlor-1-Naphthol) reagiert unter Bildung eines blauen Farbstoffs

Alkalische Phosphatase (AP)

• Neufuchsin liefert ein rosa rotes Reaktionsprodukt
• Naphthol AS-MX-Phosphat bildet ebenfalls einen roten, farbintensiven Farbstoff
• BCIP/NBT wird zu einem blauen bis violetten Reaktionsprodukt umgesetzt.

Ist ein solcher Antikörper (Primärantikörper) vorhanden, wird er mit einer Pufferlösung mit dem Gewebe zusammen inkubiert, so dass der Antikörper "sein" Protein bzw. das Antigenerkennen kann. Anschließend wird nicht gebundener Antikörper durch Inkubation in Pufferlösung weggewaschen, um unspezifische Reaktionen ("Hintergrund") zu vermeiden. Nun wird das Gewebe mit einem zweiten Antikörper (Sekundärantikörper), der gegen den konstanten Teil des ersten Antikörpers gerichtet ist, inkubiert. Dadurch wird eine Verstärkung des Signals erreicht, da mehrere Sekundärantikörper an den Primärantikörper binden können. Gleichzeitig ist der Sekundärantikörper mit einem Signalmolekül gekoppelt. Dieses kann, je nach Färbungsmethode, aus verschiedenen Stoffen bestehen. Ein verbreitetes Beispiel ist die Kopplung des Sekundärantikörpers mit alkalischer Phosphatase, einem Enzym, das NBT mit BCIP zu einem bläulich-lila Farbstoff umsetzt.

Bei dem Streptavidin-Biotin-System werden Sekundärantikörper verwendet, die mit Biotingekoppelt, das dann von Streptavidinerkannt wird, welches wiederum mit einer Peroxidaseverbunden ist. Hier setzt die Peroxidase anschließend einen Fabstoff um. Dieses System hat ebenfalls eine signalverstärkende Wirkung. Für Fluoreszenzantikörperfärbungen werden Sekundärantikörper verwendet, an die ein Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist. Fluoreszenzfärbungen haben den Vorteil, dass mit ihrer Hilfe Kolokalisationen von Proteinen nachgewiesen werden können.

Ein weiteres Verfahren zur Signalverstärkung ist beispielsweise das Tyramidsystem (Tyramid signal amplification, TSA).

Die spezifischen Antikörper können für diagnostische Methoden in der Medizin gekauft werden. Häufig handelt es sich dabei um monoklonale Antikörper. In der Forschung müssen diese Antikörper meistens durch Immunisierungvon Versuchstieren hergestellt werden.

Siehe auch: In situ-Hybridisierungen:Immunohistochemistry fr:Immunohistochimie

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